免疫熒光技術(Immunofluorescence technique )又稱熒光抗體技術，簡稱IF，是在免疫學、生物化學和顯微鏡技術的基礎上建立起來的一種蛋白示蹤技術。怎么才能得到別人那樣顏色明亮多彩又好看精準的圖片呢？讓我們先來了解什么是免疫熒光雙重染色吧！免疫熒光雙重染色是使用攜帶有不同顏色熒光標記物的抗體對同一樣本中的兩種不同抗原進行區(qū)分和定位，也稱免疫共染色。通常情況下，同時檢測組織或細胞樣本中的兩個或多個抗原時，需要進行雙重甚至多重染色。利用熒光顯微鏡或者激光共聚焦顯微鏡可看見熒光所在的細胞或組織，進而確定抗原的性質(zhì)和定位。

基本原理

根據(jù)抗原抗體特異性結(jié)合的反應原理，用已結(jié)合示蹤熒光標記物（通常是熒光標記物或者熒光蛋白）的抗體直接或間接識別抗原，示蹤物質(zhì)顯色的地方即是抗原的所在區(qū)域。

雙重染色類型

依據(jù)與抗原直接結(jié)合的抗體（通常稱之為一抗）是否帶有熒光標記物可將實驗分為直接法和間接法。

直接法

使用熒光標記物標記的一抗，直接與抗原反應。

優(yōu)點：特異性強、實驗簡便快速；

缺點：抗體用量較大、靈敏度較低。

間接法

用未標記的一抗與抗原樣本反應，然后孵育用于結(jié)合一抗的熒光標記物標記的二抗，形成抗原-一抗-二抗復合物。

優(yōu)點：靈敏度高、節(jié)省抗體；

缺點：存在非特異性染色。

基本實驗步驟

結(jié)果展示

圖2 間接法免疫熒光雙染結(jié)果

紅色熒光-K107573P

綠色熒光-K200059M

注意事項

（1）每次實驗均需設置陽性對照、陰性對照和熒光標記物對照；

（2）直接法雙重染色要求一抗的熒光標記物激發(fā)波段不同，而間接法雙重染色要求一抗不同種屬以及二抗攜帶的熒光標記物激發(fā)波段不同；

（3）雙染前，要對每個抗體進行單獨染色，確定合適染色條件和抗體定位；

（4）注意組織切片或細胞爬片全程保持濕潤；

（5）抗體孵育后，用PBS或其他洗滌液充分洗滌組織切片，去除多余抗體；

（6）對于背景較高的組織樣本，做組織封閉后效果更好。

常用熒光標記物

北京索萊寶二抗種類（均可加標）

相關產(chǎn)品（部分）

產(chǎn)品名稱	產(chǎn)品貨號
Anti-NRG1 Polyclonal Antibody	K107573P
Anti-β-Tubulin Monoclonal Antibody	K200059M
羊抗兔IgG–FITC	SF134
羊抗小鼠IgG–FITC	SF131
羊抗兔IgG-RBITC	SR134
羊抗小鼠IgG-RBITC	SR131
SAlexa Fluor 594 標記的羊抗兔IgG	K1034G-AF594
SAlexa Fluor 555 標記的羊抗兔IgG	K1034G-AF555
SAlexa Fluor 350 標記的羊抗兔IgG	K1034G-AF350
Cy5.5標記的羊抗兔IgG	K1034G-Cy5.5
Cy7標記的羊抗兔IgG	K1034G-Cy7