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肉桂醇脫氫酶（CAD）活性檢測(cè)試劑盒說(shuō)明書
微量法
注意：正式測(cè)定之前選擇 2-3 個(gè)預(yù)期差異大的樣本做預(yù)測(cè)定。
英文名稱：Cinnamyl alcohol dehydrogenase (CAD) activity assay kit
關(guān)鍵詞：肉桂醇脫氫酶|肉桂醇脫氫酶活性檢測(cè)|CAD|CAD活性檢測(cè)
貨號(hào)：BC4175
規(guī)格：100T/96S

產(chǎn)品內(nèi)容：
提取液：液體 120mL×1 瓶，4℃保存；
試劑一：粉劑×1 瓶，-20℃保存；臨用前加入 5mL 試劑三溶解?？扇芙夂蠓盅b-20℃保存，避免反復(fù)凍融。
試劑二：粉劑×1 瓶，4℃保存；臨用前加入 1mL 乙醇溶解，再將其全部轉(zhuǎn)移至 15mL 棕色試劑瓶?jī)?nèi)（盒中提供）并再加入 14mL 乙醇混勻。溶解后 4℃保存。
試劑三：液體 25mL×1 瓶，4℃保存。

產(chǎn)品說(shuō)明：
CAD 是木質(zhì)素生物合成途徑中的關(guān)鍵酶之一，催化香豆醛、芥子醛以及松柏醛等生成與之相應(yīng)的肉桂醇。該酶多存在于高等植物、酵母、菌類中，研究該酶可以探討多種生物細(xì)胞發(fā)育過(guò)程中木質(zhì)素沉積的代謝機(jī)理，為減少水果石細(xì)胞含量提高其品質(zhì)提供依據(jù)。
CAD 催化肉桂醛和 NADPH 生成肉桂醇和 NADP+，在 340nm 下測(cè)定 NADPH 消耗速率，即可反映CAD 活性。

試驗(yàn)中所需的儀器和試劑：
紫外分光光度計(jì)/酶標(biāo)儀、低溫離心機(jī)、水浴鍋、微量石英比色皿/96 孔 UV 板、可調(diào)式移液槍、研缽/勻漿器、冰、乙醇和蒸餾水。

操作步驟：
一、粗酶液提?。?/span>
組織：按照組織質(zhì)量（g）：提取液體積(mL)為 1：5~10 的比例（建議稱取約 0.1g 組織，加入 1mL提取液）進(jìn)行冰浴勻漿，然后 10000g，4℃，離心 10min，取上清，置冰上待測(cè)。
細(xì)菌或培養(yǎng)細(xì)胞：先收集細(xì)菌或細(xì)胞到離心管內(nèi)，離心后棄上清；按照細(xì)菌或細(xì)胞數(shù)量（104
個(gè)）：提取液體積（mL）為 500~1000：1 的比例（建議 500 萬(wàn)細(xì)菌或細(xì)胞加入 1mL 提取液），超聲波破碎細(xì)菌或細(xì)胞（冰浴，功率 20％或 200W，超聲 3s，間隔 10s，重復(fù) 30 次）；10000g 4℃離心10min，取上清，置冰上待測(cè)。
二、測(cè)定步驟：
1、 紫外分光光度計(jì)/酶標(biāo)儀預(yù)熱 30min 以上，調(diào)節(jié)波長(zhǎng)至 340nm，紫外分光光度計(jì)蒸餾水調(diào)零。
2、 工作液的配制：將試劑一、試劑二、試劑三按 1:1:2（V:V:V）的比例配制工作液，工作液現(xiàn)用現(xiàn)配。
3、 操作表：在微量石英比色皿/96 孔 UV 板中分別加入下列試劑：

試劑名稱 空白管 測(cè)定管
樣本（μL）        20
蒸餾水（μL）20
工作液（μL）180   180
在微量石英比色皿/96 孔 UV 板中分別加入上述試劑，充分混勻后于 340nm 處測(cè)定 10s 時(shí)的吸光值 A1，迅速置于 25℃水浴或培養(yǎng)箱 5min（酶標(biāo)儀有控溫功能可將溫度調(diào)至 25℃），拿出迅速擦干測(cè)定 5min10s 時(shí)的吸光值 A2，計(jì)算△A 測(cè)定管=A1 測(cè)定-A2 測(cè)定，△A 空白管=A1 空白-A2
空白，△A=△A 測(cè)定管-△A 空白管?？瞻坠苤恍枳鲆淮?。

三、CAD 酶活計(jì)算：
1. 按微量石英比色皿計(jì)算：
（1）按蛋白濃度計(jì)算
酶活定義：每 mg 組織蛋白每分鐘消耗 1 nmol 的 NADPH 定義為一個(gè)酶活力單位。
CAD 酶活（U/mg prot）= △A÷（ε×d）×109×V 反總÷（V 樣×Cpr）÷T= 321.54×△A÷Cpr
（2）按樣本質(zhì)量計(jì)算
酶活定義：每 g 組織每分鐘消耗 1 nmol 的 NADPH 定義為一個(gè)酶活力單位。
CAD 酶活（U/g 鮮重）= △A÷（ε×d）×109×V 反總÷（V 樣×W÷V 樣總）÷T=321.54×△A÷W
（3）按照細(xì)菌或細(xì)胞數(shù)量計(jì)算
酶活定義：每 104個(gè)細(xì)菌或細(xì)胞每分鐘消耗 1 nmol 的 NADPH 定義為一個(gè)酶活力單位。
CAD 酶活（U/104cell）= △A÷（ε×d）×109×V 反總÷（500×樣÷V 樣總）÷T
= 0.643×△A

ε：NADPH 摩爾消光系數(shù)，6.22×103L/ mol /cm；
d：比色皿光徑，1cm；
V 反總：反應(yīng)體系總體積，2×10-4L；
V 樣：反應(yīng)體系中樣本體積，0.02mL；
V 樣總：加入提取液體積，1mL；
Cpr：樣本蛋白濃度，mg/mL，蛋白濃度自行測(cè)定；
W：樣本質(zhì)量，g，
T：反應(yīng)時(shí)間：5min；
500：細(xì)菌或細(xì)胞總數(shù)，500 萬(wàn)；
109：?jiǎn)挝粨Q算系數(shù)，1mol=109nmol。
2. 按 96 孔 UV 板計(jì)算：
將將上述公式中的 d-1cm 改為 d-0.6cm（96 孔板光徑）進(jìn)行計(jì)算即可。

注意事項(xiàng)：
1、 當(dāng) A1 小于 0.8，建議將樣品稀釋后再進(jìn)行測(cè)定。
2、 空白管為檢測(cè)各試劑組分質(zhì)量的檢測(cè)孔，正常情況下，變化不超過(guò) 0.04。