活性氧（ROS）是炎癥進(jìn)展和損傷的關(guān)鍵因素。作者通過(guò)對(duì)急性炎癥性疾病血管異常的臨床觀察和實(shí)驗(yàn)驗(yàn)證，納米抗氧化劑具有高比表面積，可以借助其催化活性清除ROS，以此減少ROS引發(fā)的組織損傷并控制疾病進(jìn)展，在治療急性炎癥性疾病領(lǐng)域具有廣闊應(yīng)用前景。但是，現(xiàn)有的納米抗氧化劑（如氧化鈰、氧化鉬、氧化錳）在炎癥組織中的蓄積量較低，其ROS清除能力也亟需進(jìn)一步提升。作者提出以紅細(xì)胞囊泡作為模板和載體來(lái)提高納米抗氧化劑的治療性能。具體而言，將氧化鈰（Ce）納米晶體原位生長(zhǎng)到納米大小的紅細(xì)胞囊泡（ReV）上。Ce-ReV不僅具有優(yōu)異的生物相容性，還有極高的活性氧清除活性，這一點(diǎn)在實(shí)驗(yàn)和理論上都可以通過(guò)發(fā)現(xiàn)氧化鈰納米晶超小尺寸的粒徑（約3nm）和超高三價(jià)Ce含量（約60.8%）的獨(dú)特功能來(lái)解釋。在結(jié)腸炎和急性肝損傷模型中，Ce-ReV顯著增強(qiáng)炎癥部位的蓄積，并使ROS大量清除。此外，作者通過(guò)將ReV與間充質(zhì)干細(xì)胞外泌體融合來(lái)升級(jí)該系統(tǒng)，并在此基礎(chǔ)上原位生長(zhǎng)氧化鈰納米晶（Ce-ReMeV），新系統(tǒng)展示了對(duì)高度受損組織的額外修復(fù)功能，進(jìn)一步驗(yàn)證了令人滿意的靈活性和治療效果。

 

基本信息

題目：

期刊：Nano Today

影響因子：20.722

第一作者：趙佳偉^a,b、王玉剛^b

通訊作者：施敏^b、魏煒^a、馬光輝^a

作者單位：

a.中國(guó)科學(xué)院過(guò)程工程研究所生化工程國(guó)家重點(diǎn)實(shí)驗(yàn)室

b.上海交通大學(xué)醫(yī)學(xué)院同仁醫(yī)院

索萊寶合作產(chǎn)品：

產(chǎn)品名稱	產(chǎn)品貨號(hào)
Mouse IL-1β ELISA KIT	SEKM-0002
Mouse IL-6 ELISA KIT	SEKM-0007
Mouse TNF-α ELISA KIT	SEKM-0034
Mouse Myeloperoxidase ELISA KIT	SEKM-0118
Micro Hydroxyl Free Radical Scavenging Capacity KIT	BC1325
Micro Superoxide Anion Assay KIT	BC1295
Cell Counting KIT-8(CCK-8)	CK04
Lipopolysaccharides(LPS)	L8880
HEPES	H8090
Coomassie Brilliant Blue R-250	C8430

摘 要

失控的炎癥導(dǎo)致多種急性疾病的發(fā)病，如結(jié)腸炎和肝、肺和神經(jīng)系統(tǒng)的急性損傷。急性炎癥期間產(chǎn)生的活性氧（ROS）導(dǎo)致細(xì)胞膜氧化應(yīng)激損傷和脂質(zhì)過(guò)氧化，導(dǎo)致細(xì)胞膜通透性轉(zhuǎn)換和DNA損傷，最終導(dǎo)致器官功能障礙。雖然現(xiàn)在已經(jīng)很清楚減少或消除活性氧可以預(yù)防炎癥和相關(guān)器官損傷，但傳統(tǒng)的抗氧化劑（如維生素C、多酚、姜黃素）無(wú)法抑制由急性炎癥誘導(dǎo)的活性氧的大量產(chǎn)生，這嚴(yán)重影響了治療效果，限制了它們?cè)谂R床上的應(yīng)用。隨著納米科學(xué)和納米技術(shù)的迅速發(fā)展，具有高效清除活性氧的納米級(jí)抗氧化劑應(yīng)運(yùn)而生。一些研究報(bào)道了氧化鈰納米晶體用于治療活性氧相關(guān)疾病，包括中風(fēng)、敗血癥、眼表疾病、肝臟缺血再灌注損傷、急性腎損傷和阿爾茨海默病。除了強(qiáng)調(diào)這種材料的治療潛力外，這些關(guān)于抗氧化劑納米晶體在醫(yī)學(xué)中的應(yīng)用也面臨著新挑戰(zhàn)。例如，要確保氧化鈰納米晶體超小顆粒尺寸（最好小于5nm）以增加催化比表面積。此外，化學(xué)挑戰(zhàn)在于增加三價(jià)鈰的比例，以促進(jìn)有效的抗氧化活性。生物學(xué)上的挑戰(zhàn)是增加炎癥組織中氧化鈰納米晶體的積累，因?yàn)檫@些外源性顆粒物質(zhì)容易受到單核吞噬細(xì)胞系統(tǒng)（MPS）吞噬作用的快速清除。

在分析急性結(jié)腸炎和肝損傷的臨床表現(xiàn)和小鼠模型后，炎癥組織中的血流量顯著升高，血管內(nèi)皮破壞。根據(jù)這些病理觀察和細(xì)胞膜與金屬離子之間的靜電相互作用，作者推測(cè)，使用細(xì)胞囊泡作為載體來(lái)改善靶向積累和模板材料來(lái)調(diào)節(jié)結(jié)晶過(guò)程可以克服抗氧化劑納米晶體應(yīng)用中的上述挑戰(zhàn)。作者證明了氧化鈰納米晶體在納米級(jí)紅細(xì)胞（RBC）囊泡（ReV）膜上的原位生長(zhǎng)能延長(zhǎng)氧化鈰納米晶體在血液中的循環(huán)，并改善其在炎癥組織中的蓄積。除了用作載體外，囊泡膜還可以用作模板，溫和地優(yōu)化納米晶體的尺寸和Ce³⁺的比例，從而提高活性氧消除的效率。此外，作者通過(guò)將ReV與間充質(zhì)干細(xì)胞（MSC）衍生的外泌體融合，進(jìn)一步開發(fā)了該系統(tǒng)，為細(xì)胞囊泡提供了額外的特性，以修復(fù)高度受損的組織。上述優(yōu)勢(shì)已在小鼠結(jié)腸炎和肝損傷模型中得到系統(tǒng)驗(yàn)證，突出了這種新型抗氧化劑有效治療急性炎癥性疾病的潛力。

研究?jī)?nèi)容及結(jié)果

1.結(jié)腸炎疾病相關(guān)的病理生理學(xué)

急性炎癥組織通常表現(xiàn)為血流動(dòng)力學(xué)和血管系統(tǒng)異常。然而，這種病理生理學(xué)特征尚未被充分用于治療急性炎癥性疾病，尤其是結(jié)腸炎。因此，作者收集了結(jié)腸炎患者和健康志愿者的腹部彩色多普勒超聲影像，并比較了血流動(dòng)力學(xué)特征（圖1a）。結(jié)腸炎患者腸系膜上動(dòng)脈（SMA）的血流速度高于健康的志愿者（圖1b）。從數(shù)量上講，結(jié)腸炎患者的最大流速和平均流速大約是健康志愿者的1.3倍。結(jié)腸炎患者通過(guò)SMA的流量是健康志愿者的1.6倍（圖1c）。此外，作者研究了經(jīng)典右旋糖酐硫酸鈉（DSS）誘導(dǎo)的結(jié)腸炎小鼠模型中炎癥相關(guān)疾病的病理生理學(xué)（圖1d）。彩色多普勒超聲檢查顯示炎癥結(jié)腸組織中的血流信號(hào)增加。雙光子熒光顯微鏡測(cè)量降結(jié)腸微血管的流量，結(jié)果顯示結(jié)腸炎小鼠的血流量比健康小鼠增加1.7倍（圖1e，f）。作者同時(shí)使用雙光子熒光顯微鏡進(jìn)行熒光素血管造影，以直接評(píng)估血管結(jié)構(gòu)的破壞，這在結(jié)腸炎小鼠中可以清楚地觀察到滲漏，而在健康小鼠中幾乎沒有（圖1g和S1）。為了獲得更深入的了解，作者對(duì)血管完整性進(jìn)行了詳細(xì)的組織學(xué)檢查。掃描電子顯微鏡（SEM）分析顯示，與健康小鼠的完整血管屏障相比，結(jié)腸炎小鼠的血管內(nèi)皮完整性明顯受損，血管屏障上的缺陷變寬（圖1h），從而導(dǎo)致結(jié)腸炎小鼠的血管高熒光滲漏。

圖1 結(jié)腸炎患者和小鼠的血流速度增加，

結(jié)腸血管內(nèi)皮被破壞

2.ReV在結(jié)腸炎組織中的有效蓄積情況

受紅細(xì)胞循環(huán)持續(xù)時(shí)間的啟發(fā)，紅細(xì)胞表達(dá)膜蛋白，如CD47，有助于防止被MPS清除，作者首先選擇微尺寸的RBC（約5.8μm）和納米尺寸的ReV（約140nm），以比較大小對(duì)累積的影響（圖2a）。此外，作者選擇了與ReV大小相似的聚乳酸-乙醇酸納米顆粒（NPs），以比較不同材料的累積能力。作者通過(guò)監(jiān)測(cè)靜脈注射后的循環(huán)持續(xù)時(shí)間來(lái)比較這三種攜帶者。健康小鼠和結(jié)腸炎小鼠（由3%DSS誘導(dǎo)）的結(jié)果相似。具體而言，NPs被迅速清除，半衰期短約1.2小時(shí)，而RBC和ReV的半衰期則長(zhǎng)得多（圖2b）。對(duì)于外滲，作者使用四甲基羅丹明異硫氰酸酯–右旋糖酐作為血管內(nèi)對(duì)比劑，在體內(nèi)進(jìn)行雙光子熒光顯微鏡檢查（圖2c和d）。在健康組織和結(jié)腸炎組織中，NPs的短循環(huán)幾乎不會(huì)導(dǎo)致血管的信號(hào)外滲。盡管長(zhǎng)循環(huán)的紅細(xì)胞可以稍微改善這種情況，但它們的微小尺寸限制了結(jié)腸炎患者通過(guò)血管內(nèi)皮細(xì)胞破裂的間隙進(jìn)行的外滲。值得注意的是，具有長(zhǎng)循環(huán)和納米尺寸的ReV顯著改善了其外滲，尤其是在結(jié)腸炎組織中。因此，主要器官（結(jié)腸、心臟、肝臟、脾臟、肺和腎臟）的離體成像顯示納米級(jí)ReV，而不是其他材料在結(jié)腸中顯示出明顯的堆積（圖2e和S2）。為了定量，作者計(jì)算了結(jié)腸和肝臟中這些載體的強(qiáng)度比（圖2f）。NPs和RBC的比率分別為0.09和0.2，健康和結(jié)腸炎小鼠之間無(wú)顯著差異。相反，健康小鼠的ReV比率約為0.35，結(jié)腸炎小鼠的ReV比率甚至達(dá)到0.9。在熒光信號(hào)方面，特別是在炎癥結(jié)腸中，ReV的熒光信號(hào)比RBC高約4.5倍，比NPs高10.4倍，這表明ReV是作為治療腸道炎癥疾病載體材料的好候選材料。

圖2 探索ReV在結(jié)腸炎組織中的有效蓄積

3.氧化鈰納米顆粒功能化ReV

據(jù)報(bào)道氧化鈰納米顆粒是一種有前途的活性氧清除材料，ReV作為炎癥部位聚集的優(yōu)良載體，作者接下來(lái)用氧化鈰納米顆粒功能化ReV，以提高對(duì)結(jié)腸炎的治療性能。為此，作者開發(fā)了一種單一且溫和的一鍋法。從健康小鼠的抗凝管中收集紅細(xì)胞，并制備納米級(jí)ReV，在Ce³⁺溶液（1mM，pH=6.2）中培養(yǎng)。由于靜電作用，Ce³⁺可以吸附在ReV膜上。去除多余的Ce³⁺并將介質(zhì)pH值調(diào)節(jié)至7.4后，在ReV膜上原位生長(zhǎng)氧化鈰納米晶體（圖3a），通過(guò)透射電子顯微鏡（TEM）圖像（圖3b）和能量色散光譜（EDS）元素分析（圖3c）進(jìn)行驗(yàn)證。結(jié)果顯示，Ce-ReV保留了與ReV相似的形態(tài)和尺寸（圖S3a），而在ReV膜上觀察到許多直徑小于3nm的氧化鈰納米晶體。使用電感耦合等離子體（ICP）-質(zhì)譜（ICP-MS），發(fā)現(xiàn)鈰的負(fù)載量約為1.6 μg/10¹¹個(gè)囊泡。有了Ce-ReV，作者使用電子自旋共振（ESR）光譜進(jìn)一步測(cè)試了Ce-ReV的ROS清除性能。向分析物溶液中添加Ce-ReV后，羥基自由基、氮自由基和超氧陰離子的水平以劑量依賴的方式明顯降低（圖3d）。以20μg/mL（Ce質(zhì)量）的劑量為例，Ce-ReV可以完全清除三種類型的ROS，其光譜接近基線。然而，當(dāng)使用相同劑量的傳統(tǒng)CeO₂ NP進(jìn)行比較時(shí)，ESR信號(hào)的振幅降低。

圖3 原位氧化鈰結(jié)晶小鼠紅細(xì)胞囊泡的

制備和表征（Ce-ReV）

為了驗(yàn)證Ce-ReV活性氧清除性能強(qiáng)于傳統(tǒng)CeO₂ NPs，作者使用活性氧清除檢測(cè)試劑盒進(jìn)行定量檢測(cè)。正如預(yù)期的那樣，在同等Ce質(zhì)量下，Ce-ReV的ROS清除活性大約比CeO₂ NP高3倍（圖S4），因此強(qiáng)調(diào)了ReV作為活性增強(qiáng)的氧化鈰原位生長(zhǎng)模板的作用。除了氧化鈰納米晶體，作者還進(jìn)一步研究了它們對(duì)ReV的影響。由于制備條件非常溫和，SDS-PAGE分析顯示結(jié)晶后膜蛋白組分沒有明顯變化（圖S3b）。特別是，Western Blotting（圖S3c）顯示Ce-ReV和ReV表達(dá)相似水平的CD47，這導(dǎo)致了相似的循環(huán)行為?？紤]到氧化鈰納米晶體的參與，作者評(píng)估了Ce-ReV的生物相容性和穩(wěn)定性。正如預(yù)期的那樣，與紅細(xì)胞混合后未觀察到明顯的溶血（圖3e和S5a），與各種細(xì)胞系孵育后幾乎未檢測(cè)到細(xì)胞毒性（圖3f），靜脈注射Ce-ReV后未觀察到對(duì)血液循環(huán)和血管結(jié)構(gòu)的影響（圖S6和S7）。就穩(wěn)定性而言，在含有10%胎牛血清（FBS）的細(xì)胞培養(yǎng)基中培養(yǎng)48小時(shí)后，Ce-ReV中的Ce含量保持在90%以上（圖3g），這表明很少有氧化鈰納米晶體從ReV中分離。此外，在凍干/復(fù)水循環(huán)之前（左）或之后（右）（圖3h）或在4°C磷酸鹽緩沖鹽水（PBS）中儲(chǔ)存1周期間（圖3i），未觀察到顆粒大小或zeta電位的明顯變化。使用人類的紅細(xì)胞時(shí)，也可以觀察到具有良好活性、生物相容性和穩(wěn)定性的氧化鈰成功原位生長(zhǎng)的類似結(jié)果（圖S8和S5b）。

4.探究ReV上氧化鈰納米晶生長(zhǎng)機(jī)理

據(jù)報(bào)道，氧化鈰納米晶的尺寸和鈰價(jià)態(tài)是活性氧清除性能的兩個(gè)重要因素。具體來(lái)說(shuō)，較小的尺寸可以釋放更多的氧氣并增加更多催化部位的表面積比，并且根據(jù)Ce³⁺狀態(tài)的比例可以實(shí)現(xiàn)更多的氧氣不足以提高催化活性。因此，作者接下來(lái)評(píng)估ReV這兩個(gè)方面的組成部分的影響。鑒于細(xì)胞囊泡主要由蛋白質(zhì)和脂質(zhì)組成，作者首先使用TEM研究了在蛋白質(zhì)（牛血清白蛋白）和脂質(zhì)（1-棕櫚酰基-2-油?；蚜字琍OPC）膜存在下氧化鈰結(jié)晶的過(guò)程。同時(shí)，將水和水熱條件下的結(jié)晶作為對(duì)比（圖4a）。POPC存在下形成的氧化鈰具有超小的尺寸，這與在ReV膜上觀察到的尺寸相似（小于3 nm），而在其他條件下形成的氧化鈰顯示出更大的尺寸或明顯的聚集。

X射線光電子能譜（XPS）分析表明，膜和POPC反應(yīng)生成的氧化鈰納米晶體中三價(jià)鈰離子的比例最高（高達(dá)60.8%）（圖4b）。為了證實(shí)脂質(zhì)分子的重要作用，作者使用Cyro-TEM觀察氧化鈰在POPC膜上隨時(shí)間變化的結(jié)晶（圖4c）。由于Ce³⁺的預(yù)吸附，一次氧化鈰成核最初發(fā)生在膜上。隨著時(shí)間的推移，成核逐漸長(zhǎng)大并形成超小型氧化鈰納米晶體。作者進(jìn)行了一系列密度泛函理論（DFT）計(jì)算，以更好地理解氧化鈰結(jié)晶過(guò)程中脂質(zhì)分子的潛在機(jī)制（圖4d）。計(jì)算數(shù)據(jù)表明，在脂質(zhì)存在下，氧化鈰納米晶的形成有兩個(gè)因素：電荷轉(zhuǎn)移和成核勢(shì)壘。具體而言，POPC的存在削弱了Ce³⁺在水系統(tǒng)中的電荷轉(zhuǎn)移，從2.35e降低到1.61e，促進(jìn)了較高比例的Ce³⁺。此外，POPC的存在將氧化鈰納米晶的成核勢(shì)壘從水系統(tǒng)中的189.60降低到87.77，最終導(dǎo)致形成更小尺寸的氧化鈰納米晶（圖4e，f）。這些結(jié)果有助于理解氧化鈰納米晶體的表面積和價(jià)態(tài)是如何被脂質(zhì)分子操縱的，而這種模板效應(yīng)以前從未實(shí)現(xiàn)過(guò)。

圖4 ReV上氧化鈰納米晶生長(zhǎng)機(jī)理

5.Ce-ReV的治療效果與潛在機(jī)制

在DSS誘導(dǎo)的結(jié)腸炎小鼠模型中測(cè)試了Ce-ReV的治療潛力。在第1天、第3天和第5天，這些小鼠靜脈注射PBS、ReV、CeO₂或Ce-ReV（Ce的等效劑量為800μg/kg）。為了評(píng)估整體治療效果，在9天內(nèi)記錄體重變化，并在第9天對(duì)小鼠實(shí)施an le死，以測(cè)量結(jié)腸長(zhǎng)度（圖5a）。正如預(yù)期的那樣，ReV單獨(dú)治療在體重減輕和結(jié)腸長(zhǎng)度減少方面沒有顯示任何治療效果，這與PBS治療組相似。由于催化活性不理想，傳統(tǒng)的CeO₂及其在結(jié)腸炎組織中積累不足（圖S9），使用CeO₂治療未能實(shí)現(xiàn)體重和結(jié)腸長(zhǎng)度的實(shí)質(zhì)性改善。相反的是，與健康組相比，在炎癥結(jié)腸組織中具有強(qiáng)催化活性和有效積累的Ce-ReV在結(jié)腸炎小鼠中顯示出良好的治療效果，體重和結(jié)腸長(zhǎng)度僅略有減少（約5%）（圖5b，c）。

為了更好地理解Ce-ReV治療效果的潛在機(jī)制，作者進(jìn)行了二氫乙胺（DHE）染色以檢測(cè)結(jié)腸組織中ROS的數(shù)量（圖5d-f）。Ce-ReV治療組的三維（3D）重建雙光子顯微圖像和冰凍切片結(jié)腸組織顯示的信號(hào)強(qiáng)度均比PBS、ReV和CeO₂治療組弱得多。ROS產(chǎn)生的顯著數(shù)量促使作者進(jìn)一步研究其與炎癥的關(guān)系；因此，作者進(jìn)行了轉(zhuǎn)錄組分析，差異表達(dá)基因的層次聚類分析顯示，Ce-ReV治療顯著下調(diào)已知的炎癥基因（如Ifi202b、Il11和Tlr2），限制炎癥反應(yīng)的基因（如RasGRP3和Cd83）同時(shí)上調(diào)（圖5g）。KEGG分析揭示了已知炎癥途徑的豐富，如腫瘤壞死因子α（TNF-α）和白細(xì)胞介素17（IL-17）信號(hào)途徑（圖5h）。酶聯(lián)免疫吸附試驗(yàn)（ELISA）進(jìn)一步證實(shí)了Ce-ReV治療的抗炎作用，該實(shí)驗(yàn)顯示促炎細(xì)胞因子（IL-1β、IL-6和TNF-α）和髓過(guò)氧化物酶（MPO）的水平受到顯著抑制（圖5i）。結(jié)果表明炎性細(xì)胞浸潤(rùn)和隱窩缺失均被顯著抑制（圖5j和S10）。值得注意的是，Ce-ReV的良好治療效果也得到了臨床上廣泛使用的其他傳統(tǒng)結(jié)腸炎療法（如5-ASA和地塞米松）優(yōu)勢(shì)的證實(shí)。以結(jié)腸長(zhǎng)度為例，與健康小鼠相比，Ce-ReV組僅顯示約5.7%的減少，而5-ASA治療后仍觀察到約25.5%的減少（圖S11）。除治療結(jié)果外，Ce-ReV治療沒有在健康小鼠中誘發(fā)任何可檢測(cè)的全身毒性（圖S12），包括體重、血液學(xué)、血液化學(xué)和主要器官組織學(xué)特征的變化?？偟膩?lái)看，這些體內(nèi)實(shí)驗(yàn)結(jié)果支持Ce-ReV作為一種安全有效的治療藥物，用于對(duì)抗3%DDS誘導(dǎo)的結(jié)腸炎小鼠模型。

圖5 Ce-ReV對(duì)DSS誘導(dǎo)的

結(jié)腸炎小鼠模型的治療作用

6.Ce-ReV與MSC外泌體融合增強(qiáng)治療效果

考慮到一些病情較重的結(jié)腸炎患者遭受組織損傷，作者猜測(cè)有可能通過(guò)將生物因子納入Ce-ReV以增加組織修復(fù)功能來(lái)進(jìn)一步增強(qiáng)治療效果。鑒于從間充質(zhì)干細(xì)胞制備的外泌體含有多種生長(zhǎng)因子的報(bào)道，作者設(shè)想Ce-ReV與MSC外泌體的融合可以實(shí)現(xiàn)上述目標(biāo)（圖6a）。首先，作者從小鼠中提取骨髓間充質(zhì)干細(xì)胞，并對(duì)其特性進(jìn)行表征（圖S13a和b）。ReV與MSC衍生的外泌體融合后（圖S13c），作者進(jìn)行激光共聚焦掃描顯微鏡（CLSM）成像，以確認(rèn)ReV和MSC衍生的外泌體重疊信號(hào)中存在雜交小泡（圖6b）。通過(guò)SDS-PAGE，可在ReMeV上鑒定這兩種類型囊泡的膜蛋白，表明囊泡雜交后大部分成分保留（圖S14a）。具體而言，Ce-ReMeV的Western Blotting證實(shí)Re存在膜標(biāo)記熱休克蛋白70（HSP70）和TSG101，MSC衍生外泌體存在膜標(biāo)記HSP70、TSG101、CD9和內(nèi)因子肝細(xì)胞生長(zhǎng)因子（HGF）（圖6c和S15）。

作者成功地在雜交膜上原位生長(zhǎng)氧化鈰納米晶體，這可以通過(guò)高分辨率TEM和EDS元素分析進(jìn)行驗(yàn)證（圖6d和S14b）。晶體的尺寸小于3nm，Ce³⁺的比例仍然在60%左右，確保了高ROS清除活性（圖6e）。在成功構(gòu)建Ce-ReMeV后，作者進(jìn)一步測(cè)試了Ce-ReMeV和Ce-ReV對(duì)5%DSS誘導(dǎo)的嚴(yán)重結(jié)腸炎小鼠模型的治療潛力。實(shí)驗(yàn)設(shè)計(jì)與3%DSS誘導(dǎo)模型相似，只是由于結(jié)腸炎的迅速惡化，對(duì)體重進(jìn)行了7天的觀察（圖6f）。與觀察期內(nèi)體重迅速下降且死亡率為37.5%的PBS治療組相比，Ce-ReV和Ce-ReMeV治療組體重均下降，且兩組均無(wú)死亡（圖6g）。值得注意的是，Ce-ReMeV治療組的小鼠比Ce-ReV治療組的小鼠體重減輕較少，這表明與MSC衍生的外泌體雜交具有一定的治療益處。因此，與健康小鼠相比，PBS處理小鼠的結(jié)腸長(zhǎng)度顯著減少，而Ce-ReMeV處理小鼠的結(jié)腸長(zhǎng)度僅略有減少（1cm）（圖6h和S16a）。

圖6 含ReV和間充質(zhì)干細(xì)胞衍生外泌體與

原位結(jié)晶氧化鈰（Ce-ReMeV）囊泡的構(gòu)建及

對(duì)嚴(yán)重DSS誘導(dǎo)的結(jié)腸炎小鼠模型的治療性能

為了更好地理解Ce-MeReV對(duì)嚴(yán)重結(jié)腸炎進(jìn)一步改善治療效果的潛在機(jī)制，作者繼續(xù)研究ROS和炎癥的作用。Ce-ReV治療組ROS水平降低，炎癥細(xì)胞因子水平受到抑制，與Ce-ReV治療組相比，Ce-ReMeV治療可獲得更好的結(jié)果（圖6i、j和S16b）。在組織修復(fù)方面，HE染色顯示Ce-ReMeV通過(guò)減少隱窩缺失而優(yōu)于Ce-ReV，導(dǎo)致結(jié)腸損傷評(píng)分更低（圖6k和S16c）。Ce-ReMeV組如此良好的組織修復(fù)效果應(yīng)歸功于氧化鈰納米晶體清除活性氧和MSC外泌體生物因子的協(xié)同作用。鑒于嚴(yán)重結(jié)腸炎導(dǎo)致微生物群失衡，作者檢查了Ce-ReMeV治療是否調(diào)節(jié)了結(jié)腸炎小鼠腸道微生物群的組成。通過(guò)對(duì)V4區(qū)域的16S核糖體RNA（rRNA）基因測(cè)序?qū)S便樣本進(jìn)行分析表明，與其他治療組相比，Ce-ReMeV處理顯著提高了結(jié)腸炎小鼠的細(xì)菌豐富度，包括OTU豐富度、Chao1多樣性指數(shù)、香農(nóng)多樣性指數(shù)和辛普森多樣性指數(shù)（圖6l，m）。進(jìn)一步的家族水平分析表明，Ce-ReMeV處理顯著增加了鼠桿菌科、普雷沃菌科和類桿菌科的相對(duì)豐度（圖6n和S16d）。因此，這些結(jié)果證明了紅細(xì)胞囊泡與MSC外泌體結(jié)合的概念，并證明了Ce-ReMeV對(duì)具有廣泛組織損傷的極嚴(yán)重結(jié)腸炎模型的良好治療效果。

為了將作者的研究范圍擴(kuò)大到結(jié)腸炎之外，作者招募了ALI患者進(jìn)行腹部超聲分析（圖7a）。彩色多普勒超聲數(shù)據(jù)顯示，與健康志愿者（n=37）相比，ALI患者（n=34）的門靜脈血流速度顯著增加（增加1.35倍）。與健康小鼠相比，ALI小鼠的血流量增加了1.45倍，觀察到了類似的結(jié)果（圖7b、c和S17）。為了研究血管內(nèi)皮的潛在破壞，作者對(duì)小鼠實(shí)施an le死，并使用掃描電鏡觀察固定的肝組織（圖7d）。與血管屏障完整的健康組相比，ALI組顯示出血管內(nèi)皮完整性的破壞，血管屏障處的缺陷擴(kuò)大就是例證。這些結(jié)果表明，炎癥肝組織中存在血流速度增加和血管完整性破壞，這促使作者使用Ce-ReMeV治療ALI。

接下來(lái)，作者使用ALI小鼠模型來(lái)評(píng)估Ce-ReV和Ce-ReMeV的治療效果（圖7e）。在24小時(shí)內(nèi)每小時(shí)監(jiān)測(cè)小鼠存活情況，結(jié)果顯示PBS治療組8只ALI小鼠中有6只死亡。Ce-ReV治療后，死亡小鼠數(shù)量減少到3只，這一情況得到改善。正如預(yù)期的那樣，Ce-ReMeV治療進(jìn)一步提高了存活率，9小時(shí)時(shí)僅有一只小鼠死亡（圖7f）。在使用雙光子顯微鏡進(jìn)行活體成像后，作者觀察到存活數(shù)據(jù)與肝組織中的ROS水平高度相關(guān)（圖7g）。與出現(xiàn)活性氧大量產(chǎn)生的PBS治療組相比，Ce-ReV治療組的活性氧水平明顯降低，Ce-ReMeV治療可進(jìn)一步降低活性氧水平，接近健康對(duì)照組的水平（圖7h）。

為了評(píng)估抗炎反應(yīng)，轉(zhuǎn)基因IFN-γ生物發(fā)光報(bào)告小鼠用于體內(nèi)炎癥成像。PBS治療組的ALI小鼠在其腹部顯示出強(qiáng)烈的生物發(fā)光信號(hào)。相反，Ce-ReV治療的ALI小鼠腹部生物發(fā)光降低（圖7i和S18），而Ce-ReMeV治療組的信號(hào)強(qiáng)度被抑制到與健康對(duì)照組相似的水平。此外，使用ELISA分析受損肝組織的提取物（圖7j），作者發(fā)現(xiàn)Ce-ReV和Ce-ReMeV治療組的促炎細(xì)胞因子（IL-1β、IL-6和TNF-α）和MPO水平降低。肝組織H&E染色顯示PBS處理的ALI小鼠有嚴(yán)重出血，而Ce-ReV處理的ALI小鼠肝切片的組織損傷程度明顯降低，Ce-ReMeV處理組幾乎沒有異常（圖7k）。通過(guò)顯著抑制兩種典型的肝功能血清標(biāo)志物丙氨酸轉(zhuǎn)氨酶（ALT）和天冬氨酸轉(zhuǎn)氨酶（AST），進(jìn)一步證實(shí)了這種增強(qiáng)的治療效果，表明Ce-ReMeV治療的小鼠顯著抑制了這兩種標(biāo)志物的水平（圖7l）。此外，肝組織的TUNEL染色顯示PBS處理的小鼠有明顯的組織凋亡，而Ce-ReV和Ce-ReMeV處理的肝組織的凋亡率有下降趨勢(shì)（圖S19）。這些急性肝損傷患者的臨床發(fā)現(xiàn)和ALI模型的實(shí)驗(yàn)結(jié)果擴(kuò)展了作者在結(jié)腸炎研究中關(guān)于Ce-ReMeV治療效用的發(fā)現(xiàn)，并證明了對(duì)炎癥性肝病的發(fā)展具有強(qiáng)大的保護(hù)作用。

圖7 急性肝損傷（ALI）的腹部超聲特征和

Ce-ReMeV對(duì)ALI小鼠模型的治療作用

研究結(jié)論

研究團(tuán)隊(duì)發(fā)展了細(xì)胞囊泡表面原位生長(zhǎng)高催化活性納米晶的新策略，借助紅細(xì)胞囊泡表面的脂質(zhì)與Ce³⁺的相互作用，有效降低了氧化鈰納米晶生長(zhǎng)的能量壁壘，使晶體的粒徑降低至3nm。并且將三價(jià)氧化鈰的比例提高至60.8%，大幅度增加了其對(duì)ROS的清除能力。除此之外，紅細(xì)胞囊泡和具有組織修復(fù)功能的干細(xì)胞外泌體融合（ReMeV），在此基礎(chǔ)上原位生長(zhǎng)氧化鈰納米晶（Ce-ReMeV），借助于長(zhǎng)循環(huán)和出色的ROS清除能力，在有效清除ROS的同時(shí)，修復(fù)受損的組織和器官，延長(zhǎng)了模型小鼠的生存期，在應(yīng)對(duì)重癥急性腸炎和急性肝損傷疾病中取得顯著的治療效果。

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